Natural history of LGMD2A for delineating outcome measures in clinical trials.

Richard I, Hogrel JY, Stockholm D, Payan CA, Fougerousse F; Calpainopathy Study Group, Eymard B, Mignard C, Lopez de Munain A, Fardeau M, Urtizberea JA.

Ann Clin Transl Neurol. 2016 Mar 4; 3(4): 248-65. doi: 10.1002/acn3.287. eCollection 2016 Apr. PubMed PMID: 27081656; PubMed Central PMCID: PMC4818744.

En este estudio, se llevó a cabo una observación de las manifestaciones clínicas y progresión de la enfermedad en pacientes con LGMD2A genéticamente confirmados durante un máximo de 4 años. Un total de 85 pacientes, de edad comprendida entre 14 y 65 años, fueron reclutados en tres centros ubicados en la Francia metropolitana, País Vasco, e Isla Reunión. Fueron estudiados cada 6 meses durante 2 años y un subgrupo se evaluó posteriormente cada año durante dos años más. Los datos recogidos para todos los pacientes incluyen la historia clínica, los parámetros sanguíneos, la fuerza muscular (MMT, manual muscle testing) y la prueba muscular cuantitativa, las puntuaciones funcionales, y las funciones cardíacas y pulmonares. Además, en un subgrupo de pacientes se computarizaron las tomografías de los miembros inferiores.

RESULTADOS: Nuestro estudio confirma la descripción clínica de la distrofia de cinturas 2A como una enfermedad lentamente progresiva con inicio en la primera o segunda década de la vida con un cierto grado de variabilidad relacionada con el género y el tipo de mutación. Las mutaciones nulas conducen a un fenotipo más grave mientras que los pacientes heterocigotos compuestos son los menos afectados. La debilidad muscular es notablemente simétrica y predominante en los músculos axiales del tronco y los músculos proximales de las extremidades inferiores. Hubo una alta correlación entre la debilidad muscular a nivel del individuo según la evaluación de MMT y la pérdida de densidad en el análisis de tomografía computarizada. Este estudia es fundamental para contar con una guía de cara a futuros ensayos clínicos.

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Calpain 3 deficiency affects SERCA expression and function in the skeletal muscle.

Toral-Ojeda I, Aldanondo G, Lasa-Elgarresta J, Lasa-Fernández H, Fernández-Torrón R, López de Munain A, Vallejo-Illarramendi A.

Expert Rev Mol Med. 2016 Apr 8;18:e7. doi: 10.1017/erm.2016.9. PubMed PMID: 27055500; PubMed Central PMCID: PMC4836212.

Varios estudios han implicado a las alteraciones del calcio, como un evento subyacente en varias distrofias musculares, como la distrofia de Duchenne y la LGMD2A. En este estudio se utilizaron modelos murinos y cultivos de miotubos humanos, así como biopsias musculares con el fin de determinar si la disfunción de SERCA está implicada en la patología de la distrofia muscular. En los miotubos CAPN3 deficientes, encontramos disminución de los niveles de proteínas SERCA 1 y 2, mientras que los niveles de mRNA permanecieron similares a los miotubos control. Además, encontramos una reducción significativa en la función de SERCA que resulta en una alteración de la homeostasis de Ca2 +, y un incremento en el Ca ++ intracelular basal en miotubos humanos. Curiosamente, los niveles de proteína SERCA2 se están claramente disminuidos en los músculos de pacientes con LGMD2A, mientras que se expresa normalmente en otras formas de distrofia muscular. Por lo tanto, el análisis de la expresión de la proteína SERCA2 puede resultar útil para fines de diagnóstico como un indicador potencial del valor predictivo de  la deficiencia de CAPN3 en biopsias musculares. En conjunto, nuestros resultados indican que la deficiencia de CAPN3 conduce a la degradación de las proteínas de SERCA lo que genera una desregulación del calcio en el músculo esquelético de pacientes con distrofia LGMD2A. Este estudio permite mejorar las capacidades diagnósticas de LGMDA, además establece una base razonable para el desarrollo de estrategias terapéuticas, que tengan como objetivo modular SERCA1, SERCA2 o sAnk1 en diferentes tipos de distrofias musculares.

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Muscle wasting in myotonic dystrophies: a model of premature aging.

Mateos-Aierdi AJ, Goicoechea M, Aiastui A, Fernández-Torrón R, Garcia-Puga M, Matheu A, López de Munain A.  

Front Aging Neurosci. 2015 Jul 9;7:125. doi: 10.3389/fnagi.2015.00125. eCollection 2015. Review. PubMed PMID: 26217220; PubMed Central PMCID: PMC4496580.

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1 o enfermedad de Steinert) y tipo 2 (DM2) son trastornos multisistémicos de origen genético que generan una debilidad progresiva, atrofia y miotonía, mientras que otras manifestaciones clínicas como la cardiomiopatía, resistencia a la insulina y las cataratas también son comunes. Desde un punto de vista clínico, la mayoría de los síntomas de DM se interpretan como resultado de un envejecimiento acelerado (cataratas, debilidad muscular y atrofia, deterioro cognitivo, disfunción metabólica, etc.), incluyendo un mayor riesgo de desarrollar tumores. Desde este punto de vista, la DM1 podría ser descrita como un síndrome progeroide pues produce una notable disfunción progresiva de todos los sistemas. Esta revisión tiene como objetivo describir los procesos celulares, moleculares y macroestructurales implicados en la degeneración muscular que se han descrito en pacientes con DM, destacando las similitudes encontradas con el envejecimiento muscular y ofreciendo una visión diferente de la enfermedad de cara a encontrar nuevas dianas terapéuticas y situar a la enfermedad en otras agendas de investigación biomédica como el cáncer y el envejecimiento.

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Costamere proteins and their involvement in myopathic processes.

Jaka O, Casas-Fraile L, López de Munain A, Sáenz A.

Expert Rev Mol Med. 2015 Jun 19;17:e12. doi: 10.1017/erm.2015.9. Review. PubMed PMID: 26088790.

Para que la contracción muscular funcione correctamente, es necesario que las estructuras contráctiles de la fibra muscular (sarcómeros) estén bien conectadas con los costameros, estructuras supramoleculares asociadas con el sarcolema que permiten la adhesión del músculo a la matriz extracelular. Éstos se componen de complejos de proteínas cuyas funciones incluyen además del mantenimiento de la estructura celular, la transducción de señales. Es importante conocer que mutaciones en varios genes que codifican para las proteínas costaméricas  pueden causar muchos tipos de distrofia muscular. En esta revisión, se realiza una descripción de la estructura costamérica detallando cada una de sus proteínas constituyentes, tales como la distrofina, distrobrevina, sintrofina, sarcoglicanos, distroglicano, vinculina, talina, integrinas, desmina, plectina, etc. Asimismo, se describen las enfermedades asociadas con las deficiencias de la mismas, dando una visión general de su importancia.

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Dysregulation of calcium homeostasis in muscular dystrophies.

Vallejo-Illarramendi A, Toral-Ojeda I, Aldanondo G, López de Munain A.

Expert Rev Mol Med. 2014 Oct 8;16:e16. doi: 10.1017/erm.2014.17. Review. PubMed PMID: 25293420.

Las distrofias musculares son un grupo de enfermedades caracterizadas por la pérdida de masa primaria del músculo esquelético, lo que compromete la movilidad del paciente y, en los casos más graves origina una parálisis completa y muerte prematura. La evidencia existente implica la desregulación del calcio como un acontecimiento fundamental subyacente en la fisiopatología de varias distrofias musculares, tales como distrofinopatías, calpainopatías o la distrofia miotónica entre otros. La distrofia muscular de Duchenne es la miopatía más frecuente en la infancia, y la LGMD2A es la forma más común de distrofia muscular de cinturas mientras que la distrofia miotónica es la enfermedad muscular hereditaria más frecuente en todo el mundo. En esta revisión, se resumen los avances recientes del ciclo de iones de calcio a través del sarcolema, retículo sarcoplásmico y las mitocondrias, así como su implicación en la patogénesis de estas distrofias. También se discuten algunas de las implicaciones clínicas de los hallazgos recientes relacionados con el control de Ca2 +, así como nuevas estrategias para el tratamiento de las distrofias musculares dirigidas frente a proteínas reguladoras de Ca2 +.

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Entire CAPN3 gene deletion in a patient with limb-girdle muscular dystrophy type 2A.

Jaka O, Azpitarte M, Paisán-Ruiz C, Zulaika M, Casas-Fraile L, Sanz R, Trevisiol N, Levy N, Bartoli M, Krahn M, López de Munain A, Sáenz A.

Muscle Nerve. 2014 Sep;50(3):448-53. doi: 10.1002/mus.24263. Epub 2014 Aug 5. PubMed PMID: 24715573.

La distrofia de cinturas tipo 2A (LGMD2A) debida a mutaciones en el gen CAPN3 es una de las distrofias autosómicas recesivas más comunes. Se describe un paciente que mostraba un fenotipo típico LGMD2A y afectación del compartimento posterior en la RM. Se llevaron a cabo diferentes análisis genéticos, incluyendo el análisis de microarrays. Se descubrió una mutación aparentemente en homozigosis en el exón 24, c.2465G> T, p. (* 822Leuext62 *) pero que no segregaba con la familia lo que sugería la presencia de un reordenamiento genómico. De hecho, se encontró una deleción en heterozigosis del gen CAPN3. Esta  deleción comprendía la región terminal del gen GANC y todo el gen CAPN3. Este hallazgo señala la necesidad de reconsiderar y adaptar nuestra estrategia actual de diagnóstico molecular para detectar estos tipos de reordenamientos genómicos que escapan a los procedimientos de detección de mutaciones estándar.

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In vitro correction of a pseudoexon-generating deep intronic mutation in LGMD2A by antisense oligonucleotides and modified small nuclear RNAs.

Blázquez L, Aiastui A, Goicoechea M, Martins de Araujo M, Avril A, Beley C, García L, Valcárcel J, Fortes P, López de Munain A.

Hum Mutat. 2013 Oct;34(10):1387-95. doi: 10.1002/humu.22379. Epub 2013 Aug 7. PubMed PMID: 23864287.

La distrofia muscular tipo 2A (LGMD2A) es la distrofia muscular autosómica recesiva más frecuente. Está  causada por mutaciones en el gen de la calpaína 3 (CAPN3). La mayoría de las mutaciones descritas hasta la fecha se encuentran en la región codificante del gen. Sin embargo, se estima que existen alrededor de un 25% de mutaciones que están presentes en los límites exón-intrón y que alteran el procesamiento del pre-ARNm de CAPN3. Hemos descrito previamente la primera mutación intrónica interna en el gen CAPN3: c.1782 + 1072G> C. En el presente trabajo, utilizando el ensayo de minigen, se demuestra que esta mutación puntual provoca la pseudoexonizacion de 100 nucleótidos de la región intrónica en el ARNm maduro de CAPN3. Con objeto de restaurar el correcto procesamiento del pre-mRNA, se han ensayado estrategias basadas en el ARN, que incluyen los oligonucleótidos antisentido y pequeños ARN nucleares modificados. El mejor efecto se observó con secuencias antisentido, que indujeron el salto del pseudoexon  tanto en células HeLa cotransfectadas con el minigen mutante como en fibroblastos de un paciente que portaba dicha mutación.

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Murine muscle engineered from dermal precursors: an in vitro model for skeletal muscle generation, degeneration, and fatty infiltration.

García-Parra P, Naldaiz-Gastesi N, Maroto M, Padín JF, Goicoechea M, Aiastui A, Fernández-Morales JC, García-Belda P, Lacalle J, Álava JI, García-Verdugo JM, García AG, Izeta A, López de Munain A.

Tissue Eng Part C Methods. 2014 Jan;20(1):28-41. doi: 10.1089/ten.TEC.2013.0146. Epub 2013 Jun 22. PubMed PMID: 23631552; PubMed Central PMCID: PMC3870606

El músculo esquelético se puede generar mediante la conversión de los precursores dérmicos en progenitores musculares y miocitos diferenciados. Sin embargo, la eficiencia del desarrollo del músculo permanece relativamente baja y actualmente no está claro si esto es debido a la mala caracterización de los precursores miogénicos, a los protocolos utilizados para la diferenciación celular, o a la combinación de ambos. En este estudio, hemos caracterizado precursores miogénicos presentes en dermoesferas murinas, y evaluado los miotubos maduros cultivados en un nuevo sistema de cultivo tridimensional. Después de 5-7 días de diferenciación, se observaron miotubos aislados que contraían seguidos de contracciones espontáneas de todo el constructo de tejido muscular generado encima de una matriz extracelular (ECM). Las miofibras generadas in vitro expresaban marcadores musculares canónicos y exhibían una ultraestructura de músculo esquelético no cardíaco, con numerosas estriaciones y la presencia de mitocondrias dilatadas y alineadas, entrelazadas con el retículo sarcoplásmico (RS). Las miofibras generadas presentaban corrientes de entrada dependientes de Na+ y Ca2+ bajo la estimulación de acetilcolina (ACh) y potenciales de acción espontáneos sensibles a tetrodotixina. Además, la ACh, la nicotina y la cafeína provocaron corrientes transitorias de Ca2+ citosólico. Las contracciones de las fibras junto a estas corrientes transitorias de Ca2+ sugieren que la entrada del Ca2+ está activando la liberación de calcio inducida por calcio del RS. El bloqueo por d-tubocurarina de las corrientes de entrada y trasnistorias de Ca2+ sugieren la participación de los receptores nicotínicos. Curiosamente, después de 1 mes, los constructos generados de músculo mostraron una degradación progresiva de las fibras musculares concomitante con la infiltración de grasa, en paralelo con el curso natural de la degeneración muscular. Concluimos que los precursores miogénicos presentes en las dermoesferas murinas se pueden diferenciar a miofibras maduras encima de una ECM, en un sistema in vitro que simula algunas de las características que se encuentran en el envejecimiento y en la degeneración muscular.

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C3KO mouse expression analysis: downregulation of the muscular dystrophy Ky protein and alterations in muscle aging.

Jaka O, Kramerova I, Azpitarte M, López de Munain A, Spencer M, Sáenz A.

2012 Nov;13(4):347-57. doi: 10.1007/s10048-012-0336-7. Epub 2012 Jul 22. PubMed PMID: 22820870.

Las mutaciones en el gen CAPN3 causan  la distrofia muscular 2A (LGMD2A) caracterizada por pérdida de masa muscular y degeneración progresiva de musculatura escapular y pélvica. Se realizaron comparaciones  para ver la expresión diferencial de genes en soleo de ratones salvajes (WT) y C3KO y, en segundo lugar, para identificar las transcripciones diferenciales en el envejecimiento de los músculos de los ratones WT y C3KO. Se identificaron 2 genes diferencialmente regulados: el gen Ky, que codifica una proteasa implicada en el desarrollo muscular, y el gen que codifica una Park2 ubiquitina ligasa E3 (Parkin). El gen de Ky se infoexpresa en los músculos de los ratones C3KO que sugiere que Ky puede jugar un papel complementario en la regulación de la homeostasis del músculo en respuesta a los cambios en la actividad muscular.

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Impaired calcium calmodulin kinase signaling and muscle adaptation response in the absence of calpain 3.

Kramerova I, Kudryashova E, Ermolova N, Saenz A, Jaka O, López de Munain A, Spencer MJ.

Hum Mol Genet. 2012 Jul 15;21(14):3193-204. doi: 10.1093/hmg/dds144. Epub 2012 Apr 14. PubMed PMID: 22505582; PubMed Central PMCID: PMC3491917.

Las mutaciones en el gen de la cisteín-proteasa calpaína 3 (CAPN3) den lugar a la distrofia muscular de cinturas tipo 2A (LGMD2A). La CAPN3 se localiza en varios compartimentos subcelulares, incluyendo tríadas, donde juega un papel estructural más que proteolítico.  En ausencia de CAPN3, varios componentes de la tríada se reducen, incluyendo el receptor de rianodina (RyR). Además, la liberación de Ca (2+) tras la excitación está alterada en ausencia de CAPN3. En el presente estudio, mostramos que la señalización de la proteína quinasa Ca-calmodulina (CaMKII) se ve comprometida en ratones knockout (CAPN3 C3KO). La vía de CaMK ha sido previamente  descrita participando en la promoción del músculo esquelético lento. Como era de esperar, la disminución en la señalización de CaMKII que se observó en la ausencia de CAPN3 se asoció con una reducción en el fenotipo de la fibra muscular lenta versus rápida. Se demuestra que los músculos de los ratones WT sometidos al entrenamiento físico activan la vía de señalización de CaMKII y aumentar la expresión de la forma lenta de la miosina; sin embargo, los músculos de los ratones C3KO no presentan estos cambios de adaptación para el ejercicio. Estos datos sugieren que la respuesta de adaptación del músculo esquelético a la demanda funcional se ve comprometida en la ausencia de CAPN3. De acuerdo con nuestros estudios en ratones, los niveles de RyR también se redujeron en biopsias de pacientes con LGMD2A. Por otra parte, se observó una implicación patológica preferencial de las fibras lentas en las biopsias LGMD2A. Por lo tanto, la alteración de la señalización de CaMKII y, como resultado, respuesta de adaptación de un músculo debilitado identifica un nuevo mecanismo que puede ser la base de la LGMD2A y ser una diana farmacológica que debería ser explorada para la terapia.

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Does the severity of the LGMD2A phenotype in compound heterozygotes depend on the combination of mutations?

Sáenz A, Ono Y, Sorimachi H, Goicoechea M, Leturcq F, Blázquez L, García-Bragado F, Marina A, Poza JJ, Azpitarte M, Doi N, Urtasun M, Kaplan JC, López de Munain A.

Muscle Nerve. 2011 Nov;44(5):710-4. doi: 10.1002/mus.22194. PubMed PMID: 22006685.

INTRODUCCIÓN: La distrofia muscular de cinturas tipo 2A tipo (LGMD2A) es causada por deficiencia de la calpaína-3 / p94. Aunque los síntomas en la mayoría de los pacientes con LGMD2A son generalmente homogéneos, han descrito variaciones en la gravedad y progresión de la enfermedad.

Métodos: Se describen 2 pacientes que portan la misma combinación de mutaciones, heterocigotos compuestos (pG222R / pR748Q), cuyos síntomas son excepcionalmente benignos en comparación con los homocigotos de las mismas mutaciones.

Resultados: El fenotipo benigno observado en asociación con las mutaciones pG222R y pR748Q sugiere que este puede ser por un efecto compensatorio de la composición de ambas más que por las propias mutaciones individuales. Nuestros análisis revelaron que estas dos mutaciones ejercen diferentes efectos sobre la actividad proteasa de la calpaína-3, lo que sugiere « complementación molecular » en estos pacientes.

CONCLUSIÓN: Proponemos varias hipótesis para explicar cómo esta combinación específica de mutaciones puede rescatar la actividad proteolítica normal de calpaína-3, lo que resulta en un fenotipo excepcionalmente benigno.

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